GLP-1(link:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) er et polypeptidhormon bestående af 30 aminosyrer. Med den dybtgående forskning i GLP-1 er der udviklet flere og flere syntetiske metoder. Denne artikel vil systematisk introducere de aktuelt kendte syntesemetoder for GLP-1.
Metode 1, fastfasesyntese:
Fastfasesyntese er en meget brugt metode til peptid- og proteinsyntese og er også almindeligt anvendt til syntese af GLP-1. Ved fastfasesyntese dannes kernestrukturen ved at forbinde den første aminosyre til harpiksen. Dernæst tilsættes den næste aminosyre i rækkefølge og omsættes kemisk med et passende kondenseringsmiddel. Endelig kan målproduktet opnås ved at spalte polypeptidet fra harpiksen.
Betydningen af fastfasesyntese er, at den muliggør automatisering og storskalaproduktion af peptidsyntese. De nuværende almindelige fastfasesyntesemetoder omfatter Fmoc og Boc. Blandt dem bruger Fmoc-metoden N-Fmoc-beskyttelsesgruppen til at beskytte peptidet, mens Boc-metoden bruger tert-butyloxycarbonyl til at beskytte carboxylgruppen.
Metode to, væskefasesyntese:
Væskefasesyntese er en traditionel metode til peptidsyntese, hvor reaktanterne placeres i væskefasen til reaktionen. Fordelen ved væskefasesyntese er, at reaktionsbetingelserne er milde og egnede til modifikation af følsomme kemiske strukturer. Men på grund af for mange reaktanter er rensningsprocessen relativt besværlig. Kemiske reaktioner i væskefasesyntese omfatter:
1. Kondensationsreaktion:
Kondensationsreaktion er en af de mest basale reaktioner i peptidsyntese, det vil sige, at carboxylgruppen initieret af kondenseringsmidler såsom DCC og HOBt er forbundet med aminogruppen i aminosyren gennem acyleringsreaktion. Reaktionsbetingelserne er milde, og udbyttet er højt.
2. Eliminationsreaktioner:
Elimineringsreaktionen er at reducere methioninen til dithiol med NaBH4 og andre reduktionsmidler, hvilket gør den inaktiv. Reaktionen skal udføres under basiske betingelser.
3. Fjernelse af beskyttelsesgrupper:
På grund af de forskellige funktioner af aminosyrer i peptidkæden, vil forskellige beskyttelsesgrupper blive brugt til beskyttelse. Efter at syntesen er afsluttet, skal den beskyttende gruppe fjernes. Til Fmoc-metoden bruges piperidin normalt til at fjerne Fmoc; mens for Boc-metoden bruges TFA til at fjerne Boc.
Metode tre, kemisk syntese:
GLP-1 er et polypeptidhormon med vigtige biologiske aktiviteter. Dets syntese kan realiseres ved forskellige metoder, blandt hvilke kemisk syntese er en af de mest almindeligt anvendte metoder. Fordelen ved kemisk syntese er, at den kan producere meget rene målprodukter, som er velegnede til produktion i stor skala. Den kemiske syntesemetode og detaljerede trin for GLP-1 vil blive introduceret nedenfor.
1. Syntetisk rute og beskyttelsesgruppevalg:
GLP-1-molekylet består af 36 aminosyrer, herunder 21 L-type og 15 D-type aminosyrer. Før syntesen udføres, er det nødvendigt at vælge en passende syntesevej og vælge den tilsvarende beskyttelsesgruppe i overensstemmelse med de syntetiske betingelser. Fmoc-fastfasesyntese bruges normalt til automatiseret storskalasyntese. Denne metode bruger N-9-fluoroimidocarboxylbeskyttelse (N-Fmoc) som en beskyttelsesgruppe og skal også vælge en passende sekundær beskyttelsesgruppe (såsom tert-butyl eller methyl) for at sikre beskyttelsen af specifikke steder. Hver gang en ny aminosyre tilføjes, skal Fmoc-beskyttelsesgruppen fjernes først, og derefter tilføjes det beskyttede koblingsstof fra den næste aminosyre.
2. Syntese af kerneaminosyresekvensen:
Kernesekvensen af GLP-1 består af 21 aminosyrer, herunder en nøgleserin og fire prolylglutaminsyredipeptidsekvenser. Ved fastfasesyntese kan syntesen af kernesekvensen opdeles i følgende trin:
2.1. Tilsæt eddikesyrecarbamat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) og 2-Cl-Trt-Cl til fastfase syntetisk harpiks, og udfør kondensationsreaktion med DIC/NMM-koblingsmiddel.
2.2. Fjern Fmoc-beskyttelsesgruppe ved at afbeskytte gruppereaktion.
2.3. Tilføj den næste aminosyre, gentag trin 1 og trin 2 i rækkefølge, indtil kernesekvensen er syntetiseret.
2.4. Dannelse af pentapeptidstrukturer på fastfaseharpiks. Tilføj acetaliseringsreagenset til fastfase-harpiksen, reager med det N-terminale genkendelsesmiddel (såsom HBTU), tilsæt sidekædebeskyttelsesgruppen af serin som et hjælpereduktionsmiddel, og fjern derefter Fmoc-beskyttelsesgruppen.
2.5. Under katalyse af Bacillus subtilis-transferase (ProTide) gennemgår pentapeptidstrukturen en udvekslingsreaktion med forstadiet til serin-iodacetat.
3. Syntese af den resterende aminosyresekvens:
Efter at have afsluttet syntesen af kernesekvensen, er det nødvendigt at fortsætte med at tilføje de resterende aminosyrer, herunder L- og D-type aminosyrer. Tilføjelsen af disse aminosyrer skal starte fra kernesekvensen, tilføje den næste aminosyre i rækkefølge og bruge det tilsvarende kondenseringsmiddel til at udføre kemiske reaktioner, indtil et komplet GLP-1 polypeptidmolekyle er syntetiseret. Under denne proces er det også nødvendigt at vælge en passende beskyttelsesgruppe efter behov, og at udføre trinene med reaktion, fjernelse af beskyttelsesgruppe og tilføjelse af aminosyre i rækkefølge.
4. Natriumhydroxidbehandling:
Efter at alle aminosyrerne er blevet tilføjet, dannes en ufuldstændigt syntetiseret peptidkæde på fastfase-harpiksen og skal behandles for at danne et fuldt dannet peptidmolekyle. For det første skal det uformede peptid hydrolyseres af natriumhydroxid, således at den C-terminale carboxylgruppe, der oprindeligt var knyttet til harpiksen, løsnes fra harpiksen, og beskyttelsesgruppen løsnes i vand. Efter hydrolysereaktion opnås målproduktet.
5. Nedfældning og vask:
Efter behandlingen behandles den hydrolyserede opløsning med syre for at udfælde målproduktet. Derefter blev pelleten resuspenderet i vand efterfulgt af intensiv vask for at fjerne urenheder.
6. Oprensning:
Det sidste trin er rensning af det ønskede produkt, sædvanligvis ved hjælp af højtydende væskekromatografi. Under denne proces kan produktets renhed bestemmes ved at detektere toppen af opløsningen i massespektret. Kort sagt kræver den kemiske syntese af GLP-1 flere runder af komplekse reaktioner og strenge oprensningsprocesser for endelig at opnå det aktive målprodukt.
Metode fire, biosyntese:
GLP-1 er et vigtigt polypeptidhormon med forskellige fysiologiske virkninger, herunder fremme af insulinsekretion, undertrykkelse af appetit, reduktion af kropsvægt og opretholdelse af insulinfølsomhed osv. Biosyntesemetoden for GLP-1 syntetiseres hovedsageligt af L-celler i bugspytkirtlen, og dens syntesehastighed reguleres med kosten. De detaljerede trin introduceres som følger:
1. Forberedende arbejde før syntese:
Før biosyntesen af GLP-1 skal der udføres noget forberedende arbejde, herunder bestemmelse af den anvendte celletype, indstilling af dyrkningsbetingelserne og udvælgelse af det passende katalytiske enzym. L-celler er hovedkilden til GLP-1-syntese, fordi de indeholder forstadier til to hormoner, GIP (glukagon-lignende peptid 1) og GLP-1. L-celler kan isoleres fra tarmepitel fra kaniner eller mus. Før biosyntese skal celler dyrkes til et tilstrækkeligt antal, og tilstrækkelige næringsstoffer og passende dyrkningsbetingelser skal tilvejebringes. Derudover er det nødvendigt at vælge det passende katalytiske enzym for at fremme reaktionen.
2. Syntese og behandling af prækursorer:
Biosyntesen af GLP-1 foregår hovedsageligt i L-celler, og dets forløber er sammensat af to hormoner, GIP og GLP-1. Efter indtræden i endokrine celler behandles GIP og GLP-1 af proteolytiske enzymer og spaltes til individuelle peptider. En række enzymer og cofaktorer er involveret i denne proces, herunder precursor polypeptid acidase (PC2), isomerase og sene adhæsionsfaktorer.
3. Gensidig konvertering mellem polypeptidsegmenter:
Efter behandling kombineres GIP- og GLP-1-peptiderne for at danne GLP-1-polypeptidet. Denne proces kræver brugen af glucagon-lignende peptid 1 (GLP-1) som en skabelon, hvortil andre individuelle peptider kombineres for at danne nye sammensatte polypeptider. Denne proces kræver også nogle specifikke enzymer og faktorer, herunder Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) og Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1 sekretion:
Efter at GLP-1 er syntetiseret og behandlet, lagres det i cytoplasmaet og de indre vesikler i endokrine celler. Når de stimuleres af kosten, frigiver endokrine celler GLP-1 og kommer ind i blodcirkulationen gennem mikrokar. Denne proces reguleres og kontrolleres gennem en række signaltransduktionsveje, herunder cAMP-Ca2 plusog så videre.
Kort sagt involverer biosyntesen af GLP-1 en fælles handling af flere links og faktorer. Kombinationen af biosyntese og kemisk syntese kan give et bedre grundlag og støtte til forskning og produktion af GLP-1.
Metode fem, enzymatisk syntese:
Enzymatisk syntese er syntesen af peptidkæder gennem katalyse af biologiske enzymer. Sammenlignet med traditionelle væskefasesyntesemetoder kan enzymatisk syntese udføres ved stuetemperatur, og en bred vifte af råmaterialer kan vælges. Enzymer såsom theta-væskesyntase, AEP, ACE osv. bruges normalt til at katalysere syntesen.
Som konklusion er de ovennævnte metoder mulige metoder til GLP-1-syntese. Forskellige metoder er velegnede til forskellige eksperimentelle forhold og farmaceutiske produktionsmiljøer.